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实验仪器耗材:细胞培养的步骤和注意事项

实验仪器耗材:细胞培养的步骤和注意事项
实验仪器耗材:细胞培养的步骤和注意事项
实验仪器耗材:细胞培养的步骤和注意事项
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编辑时间 : 2020-06-23

  

  1.细胞复苏

  冷冻细胞从液氮中取出后,在37的水浴中摇动以促进其融化。实验仪器耗材将融化的细胞转移到离心管中,加入预热到37的DMEM完全培养基(其中胎牛血清约为10%),轻轻吹,离心,以500克离心2分钟,弃去上清液。

  加入DMEM全培养基清洗,弃去上清液。加入DMEM全培养基,轻轻吹匀,制成细胞悬液,接种于培养皿/瓶中,在含5% CO2的细胞培养箱中培养。

  2.细胞传代

  当细胞密度达到80%~90%(早期产量不足,晚期细胞状态不好,继代比在1:2 ~ 1:10以上,一般为1:3 ~ 133605个细胞世代,即从细胞接种到分离和再培养的时间,以及非细胞有丝分裂的次数)时,取出完整的培养基,用1X  PBS洗涤两次。


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  加入胰蛋白酶(注意:消化液的最佳量是覆盖细胞,最佳消化温度是37。显微镜下观察细胞:倒置显微镜下观察消化细胞。如果细胞质收缩,细胞将不再连接成碎片,表明此时细胞已被适度消化,并将其放入细胞培养箱中约2-3分钟。

  加入适量DMEM完全培养基停止胰蛋白酶消化,日本亚速旺asone转移至离心管,离心500g,时间2分钟,弃去上清液,然后加入DMEM完全培养基清洗,弃去上清液。

  加入DMEM完全培养基,轻轻吹混,吸取10微升进行计数,然后根据所需细胞数量在含5% CO2的细胞培养箱中继续培养。

  3.细胞冷冻保存

  当细胞密度达到80%~90%时,取出完整培养基,用1X  PBS洗涤两次。加入胰蛋白酶进行消化,将混合物放入细胞培养箱中约2-3分钟。加入DMEM完全培养基停止胰蛋白酶消化,转移至离心管,500g离心2分钟,弃去上清液,加入DMEM完全培养基清洗,弃去上清液。加入1毫升冷冻溶液(90%胎牛血清,10%二甲基亚砜)。一般来说,血清含量可以在10%和90%之间调节。向冷冻溶液中加入血清一方面可以为细胞提供营养,另一方面可以提供不可渗透的保护物质,如蔗糖和白蛋白,以便在冷冻过程中更好地保护细胞。放入冷冻管中(管中放入异丙醇以保证降温速度),立即放入4冰箱中30分钟,然后放入-

  第二天,它可以在液氮中储存至少两年,如果不释放液氮,它可以储存三个月。

  细胞冷冻保存和复苏的原理是:缓慢冷冻和快速融化,这更有利于维持细胞的活力。在没有任何保护剂的情况下冷冻保存的细胞将导致细胞中冰晶的产生,这将对细胞造成内源性机械损伤,引起细胞内环境中渗透压、酸碱度和电解质的变化,然后促进细胞死亡。4.预防措施

  (1)培养液预热:将制备好的含有培养液、PBS和胰蛋白酶的瓶子在37水浴中预热;

  (2)用75%酒精擦拭紫外线照射的洁净工作台和手;

  (3)正确放置使用过的仪器:保证足够的操作空间,既方便操作,又减少污染;

  (4)点燃酒精灯:注意火焰不能太小;

  (5)严格无菌操作;

  (6)贴壁细胞的适度消化:消化时间受许多因素的影响,日本东日tohnichi如消化液的类型、制备时间和加入培养瓶中的量。在消化过程中,应注意培养细胞的形态变化。一旦细胞质收缩,连接变得松散,或有碎片漂浮的迹象,消化应立即停止;

  (7)传代细胞的所有操作应尽可能靠近酒精灯的火焰。最好一次只操作一个电池,每个电池使用一套设备。避免交叉感染;

  (8)每次打开或关闭通道细胞的瓶口时,都需要用酒精灯消毒。


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